本发明公开了一种防治稻纹枯病药物的药效测定方法，利用一组简单便利的器具，在离体水稻叶片上测定药物对稻纹枯病发病的防治效果，该方法的步骤如下：1）水稻叶片的培育准备；2）器具准备；3）病菌的培养准备；4）防治药物的配备；5）测定用离体叶片的准备；6）药物施用；7）接种病菌；8）施药后或接种后的处置。本发明的优点是：1）接种发病较为稳定一致；药效结果重现性好，且查录容易量化；测试耗时短。2）可避免出现有效药物的漏选。3）离体叶片采样方便；室内操作；便于跟踪药物在发病扩展过程中的作用；测定过程操作简单易行，且局部条件控制方便；容易实现测定方法的标准化。
1.一种防治稻纹枯病药物的药效测定方法，其特征在于，利用一组简单便利的器具，在离体水稻叶片上进行接种发病和药物处理，测定药物对稻纹枯病的防治效果，方法的步骤如下：1）水稻叶片的培育准备：按一般方法种植水稻植株，常规水肥管理，培育至6叶期后使用；2）器具准备：器具包括大方盘、小方盘、玻璃罩、和玻璃板；用洁净剂将这些器具洗涤干净后备用；3）病菌的培养准备：将测定用的病菌菌株移植到PSA平板培养基上，PSA培养基为：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g和水1000ml，在温度30℃条件下培养至菌落刚长满平板，取直径为6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌丝琼脂圆块，以此菌丝块作为接种测定用的接种体；4）防治药物的配备：用清水将防治药物溶解或稀释，并将有效成分调配成需要测定的浓度，并以空白清水作无药处理对照（CK）；5）测定用离体叶片的准备：用干净剪刀采集步骤1）准备的水稻植株上完全展开的正常叶片，置入盛装清水的干净容器中带回室内；取出步骤2）备好的组件，将小方盘置于大方盘内的中间，取2个干净的普通橡皮筋分别套在玻璃板的上下两头，并将玻璃板置于小方盘内架成稳定的倾斜状态，然后往小方盘内注入清水；将采回的叶片基部朝下，平行插摆于玻璃板与橡皮筋之间，橡皮筋将叶片的两端夹稳，叶片基端插入小方盘内的清水层内，剪除超出玻璃板上缘的叶片尾部；6）药物施用：用喷雾器将步骤4）配备的待测药液喷到步骤5）备好的叶片上，直至叶片上均匀布满雾滴为止；7）接种病菌：用干净镊子挑取步骤3）准备的菌丝块贴放于步骤5）准备好的离体叶片上；8）施药后或接种后的处置：取玻璃罩将小方盘以及盘内的离体叶片全部罩在大方盘上，并往大方盘内注入清水，使玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态；然后将整套装置放于具备正常散射光的普通室内培养，培养温度维持在26℃±1℃波动范围；9）变动实施步骤测定药物防治效果的作用方式：通过改变步骤6）与步骤7）实施的先后次序，能实现测定药物对病害的防治作用方式，如下：A.先实施步骤6）再到步骤7）；或先操作步骤7），在菌丝生长侵染之前操作步骤6）；结果能体现药物防治的保护作用；B.先实施步骤7），培养24小时发病后，再实施步骤6），结果能体现药物防治的治疗作用；结果观察调查：一般接种病菌24小时后，无药物的对照处理出现清晰稳定的发病反应，有防治作用的药物处理，与对照处理相比发病程度减轻或不发病；发病程度可用病斑高度（或称病斑长度）的量化指标来衡量，病斑高度是指从接种点到病斑最前沿的距离；通过量化指标计算药物的防治效果（药效）；防治效果（%）=（对照处理的病斑高度-药物处理的病斑高度）×100/对照处理的病斑高度。技术领域
本发明涉及农业技术和生物技术。具体是一种防治稻纹枯病药物的药效测定方法。
背景技术
稻纹枯病是水稻的首要病害，每年可引起我国60亿多公斤的稻粮损失，由于与该病害防病控害有关的许多基础研究滞后，当前及相当一段时期内，该病害的防治仍主要依赖农药防治；当前的防治药剂主要是井冈霉素，由于用药单一，且井冈霉素与人类医学用抗菌素密切有关，因此生产上需要寻找替代药物和更多的可用药物；那么，加快加强防治药物的筛选鉴定显得非常必要；而高效便捷的测定方法对筛选鉴定工作无疑很有益。根据药效测定时，药物作用对象病原菌所处的背景条件，药效测定方法可有如下3类主要方法：培养基生物测定法、活体植株测定法、和组织测定法。培养基生物测定法在培养基上测定药物对病原菌的抑制作用，该方法的严重不足是会漏选有效药物；活体植株测定法是在活体植物上测定药物对病害的作用效果，该方法的突出弊病是，费时耗力、及试验条件难控等；组织测定法是在离体的植物器官组织上测定药物对病害的作用效果，该方法可克服前面2类方法的弊病，因而成了近年备受重视的药效测定方法。在稻纹枯病的药物筛选中，已有2种较为成熟的组织测定法，即离体蚕豆叶测定法和离体水稻叶鞘测定法，前者以离体蚕豆叶片为组织材料，测定药物对稻纹枯病菌侵染离体蚕豆叶片的防治效果，后者以离体水稻叶鞘为组织材料，测定药物对稻纹枯病菌侵染离体水稻叶鞘的防治效果。实际应用中，两者都存在某些弊病。蚕豆叶测定法仍有可能漏选那些在蚕豆上无效、而在水稻上有效的药物，而且蚕豆叶较小，不利于进行药物的作用过程跟踪。水稻叶鞘测定法中，由于水稻各叶鞘属于外叶鞘包内叶鞘并相互环抱式生长，试验中取材叶鞘不够方便；接种发病的均匀性和稳定性欠佳等。
发明内容
本发明的目的是提供一种便捷的防治稻纹枯病药物的药效测定方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种防治稻纹枯病药物的药效测定方法，依据稻纹枯病菌也能侵染水稻离体叶片，且发病较为均匀和稳定的特性，利用一组简单便利的器具，进行离体叶片的接种发病和药物处理，测定药物对稻纹枯病发病的防治效果，测定方法的步骤如下：1.水稻叶片的培育准备：按一般方法种植水稻植株，常规水肥管理，培育至6叶期后使用。2.主要器具准备：主要器具包括大方盘、小方盘、玻璃罩、和玻璃板；用洁净剂将这些器具洗涤干净后备用。3.病菌的培养准备：将测定用的病菌菌株移植到PSA平板培养基上，PSA培养基为：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g和水1000ml。在温度30℃条件下培养至菌落刚长满平板，取直径为6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌丝琼脂圆块，以此菌丝块作为接种测定用的接种体。4.防治药物的配备：用清水将防治药物溶解或稀释，并将有效成分调配成需要测定的浓度，并以空白清水作无药处理对照（CK）。5.测定用离体叶片的准备：用干净剪刀采集步骤1准备的水稻植株上完全展开的正常叶片，置入盛装清水的干净容器中带回室内。取出步骤2备好的组件，将小方盘置于大方盘内的中间，取2个干净的普通橡皮筋分别套在玻璃板的上下两头，并将玻璃板置于小方盘内架成稳定的倾斜状态，然后往小方盘内注入清水。将采回的叶片基部朝下，平行插摆于玻璃板与橡皮筋之间，橡皮筋将叶片的两端夹稳，叶片基端插入小方盘内的清水层内，剪除超出玻璃板上缘的叶片尾部。6.药物施用：用喷雾器将步骤4配备的待测药液喷到步骤5备好的叶片上，直至叶片上均匀布满雾滴为止。7.接种病菌：用干净镊子挑取步骤3准备的菌丝块贴放于步骤5准备好的离体叶片上。8.施药后或接种后的处置：取玻璃罩将小方盘以及盘内的离体叶片全部罩在大方盘上，并往大方盘内注入清水，使玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态；然后将整套装置放于具备正常散射光的普通室内培养，培养温度维持在在26℃±1℃波动范围。9.变动实施步骤测定药物防治效果的作用方式：通过改变步骤6与步骤7实施的先后次序，能实现测定药物对病害的防治作用方式，如下：A.先实施步骤6再到步骤7；或先操作步骤7，在菌丝生长侵染之前操作步骤6；结果能体现药物防治的保护作用。B.先实施步骤7，培养24小时发病后，再实施步骤6，结果能体现药物防治的治疗作用。结果观察调查：一般接种病菌24小时后，无药物的对照处理出现清晰稳定的发病反应，有防治作用的药物处理，与对照处理相比发病程度减轻或不发病；发病程度可用病斑高度（或称病斑长度）的指标来衡量，病斑高度是指从接种点到病斑最前沿的距离；通过量化指标计算药物的防治效果（药效）。防治效果（%）=（对照处理的病斑高度-药物处理的病斑高度）×100/对照处理的病斑高度本发明的优点是：1）接种发病较为稳定一致；药效表现直观清晰，结果重现性好，且查录容易量化。2）可避免出现有效药物的漏选。3）采用较长的叶片，便于跟踪药物在发病扩展过程中的作用。4）测试耗时短，一般比叶鞘测定法提前1～2天。6）离体叶片采样方便，测定过程操作简单易行。7）室内操作，占空间少，局部条件控制方便，容易实现测定方法的标准化。
附图说明
图1是本发明药效测定用的配套器具。图中，大方盘a，小方盘b，玻璃板c，玻璃罩d。A图是用小金属片把玻璃板c临时架成稳定的倾斜状态；B图是不用金属片而直接用玻璃胶和一小块玻璃将玻璃板c粘接成固定的倾斜状态；C图是用玻璃罩d将小方盘b以及盘上的玻璃板c罩在大方盘a上的侧面观；D图是在C图的玻璃板c上放置水稻叶片后的正面观。图2是本发明在配套器具中的玻璃板上放置离体叶片及接种病菌后的正面观。图3是本发明药效测定结果示意图。图中，A图是无药物处理的对照发病表现；B图是无药物处理和未接种病菌的空白对照；C图是施药处理的叶片发病轻的表现；D图是施药处理的叶片不发病的表现。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步描述。本发明利用稻纹枯病菌可侵染离体水稻叶片发病的特性，使用一组便利的配套器具，在离体稻叶上测试防治药物对病菌侵染致病的防治作用。所用的配套器具如图1所示，主要组件为大方盘、小方盘，倾斜放置的玻璃板、和玻璃罩；2个方盘为贮水用，玻璃板为承载叶片用，玻璃罩起封闭保湿用。使用时，由于叶片在玻璃板上被固定并整齐展开，如图2所示，对叶片实施接种和施药操作非常方便；而且玻璃罩的打开与罩回均未触及罩内的试验材料，因而可以根据需要反复开闭玻璃罩实施接种或施药操作。本发明用的离体叶片在温度为26℃±1℃条件下，一般可维持7天以上的正常绿叶，试验无需额外添加保鲜剂处理。如图2所示的叶片经接种稻纹枯病菌后，在26℃±1℃温度范围内培养，无药处理的对照叶片，一般接种24小时后开始发病，病斑沿着菌丝生长的方向不断扩展，并形成较为清晰一致的坏死病斑，如图3的A图所示；而未接种病菌的叶片保持正常的绿叶，如图3的B图所示；经过接种病菌并施药处理的叶片表现为发病轻或不发病，如图3的C图和D图所示。发病程度可用病斑高度（或称病斑长度）的量化指标来衡量，病斑高度是指从接种点到病斑最前沿的距离；药物的防治效果（药效）可按如下公式计算：防治效果（%）=（对照处理的病斑高度-药物处理的病斑高度）×100/对照处理的病斑高度实施例1应用本发明一种防治稻纹枯病药物的药效测定方法，以水稻品种中优679和稻纹枯病菌菌株Rs-1为材料，测定药物井冈霉素以不同有效浓度防治稻纹枯病的防治效果，按如下步骤实施操作：1.水稻叶片的培育准备：按一般方法栽培水稻品种中优679，常规水肥管理，生长至6叶期后使用。2.主要器具准备：测试用的主要器具包括：如图1所示的大方盘a、小方盘b、玻璃板c、玻璃罩d等组件。本实施例器具的用材与大小：大方盘a为长×宽×高=40×30×3cm的普通方盘；小方盘b为长×宽×高=29×22×3cm的普通方盘；玻璃板c为24×24cm的普通玻璃板；玻璃罩d为长×宽×高=31×25×20cm的有机玻璃罩；图1的A图中的薄金属片，折钩后长度为15cm。用洁净剂将这些组件洗涤干净后备用；3.病菌的培养准备：将菌株Rs-1移植到PSA平板培养基上，PSA培养基为：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g和水1000ml。在温度30℃条件下培养至菌落刚长满平板，取直径为6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌丝琼脂圆块，以此菌丝块作为接种测定用的接种体。4.防治药物的配备：用清水将防治药物20﹪的井冈霉素水溶粉剂（浙江钱江生物化学股份有限公司的产品）溶解，并将施用药液的有效成分浓度调配为3个施用浓度：104.2μg/ml，6.1μg/ml，1.2μg/ml；其中104.2μg/ml为一般田间应用浓度；而另2个浓度6.1μg/ml和1.2μg/ml是处于防治效果易变的浓度范围；以空白清水处理作无药处理对照（CK）。5.测定用离体叶片的准备：用干净剪刀采集步骤1准备的水稻植株上完全展开的正常叶片，置入盛装清水的大烧杯中带回室内。取出步骤2备好的组件，将小方盘置于大方盘内的中间，取2个干净的普通橡皮筋分别套在玻璃板的上下两头，并将玻璃板以倾斜状态置于小方盘内，如图1的B图所示，或者按图1的A图方式用金属片临时架成稳定的倾斜状态，然后往小方盘内注入深厚清水（约占小方盘深度的75%）。将采回的叶片基部朝下，平行插摆于玻璃板与橡皮筋之间，橡皮筋将叶片的两端夹稳，叶片基端插入小方盘内的清水层内，然后将超出玻璃板上缘的尾部叶片剪除，如图2所示。6.药物施用：用手持喷雾器将步骤4配备的测试药液喷到步骤5备好的叶片上，直至叶片上均匀布满雾滴为止。7.接种病菌：用干净镊子挑取步骤3准备的菌丝块贴放于步骤6操作完备的离体叶片上，如图2所示。8.施药后和接种后的处置：取玻璃罩将小方盘以及盘内的离体叶片全部罩在大方盘上，并往大方盘内注入薄层清水，使玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态；然后将整套装置放于具备正常散射光的普通室内培养，培养温度维持在26℃±1℃波动范围。结果：接种培养3天后，无药处理对照叶片发病病斑高度达11.13cm,而施用井冈霉素药液处理的叶片发病减轻，表现出有防治效果，在生产使用浓度下（104.2μg/ml），显示出高效的防治作用（93.80%）；当药液有效浓度减少，防治效果跟着下降（见表1）。本实施例的防治药物井冈霉素是在病菌侵染之前施用，因而结果体现的是井冈霉素的保护作用。表1用本发明的方法测定药物井冈霉素在不同浓度下的防治效果ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例2应用本发明一种防治稻纹枯病药物的药效测定方法，以水稻品种中优679和稻纹枯病菌菌株Rs-2为材料，测定药物丙环唑以不同浓度防治稻纹枯病的防治效果，按实施例1的步骤1至步骤8操作实施，但与实施例1不同的是：步骤3培养准备的菌株是Rs-2。步骤4配备的防治药物是25﹪的丙环唑乳油（江苏丰登农药有限公司产品），有效成分浓度调配为3个施用浓度：187.5μg/ml，55.2μg/ml，5.0μg/ml；其中187.5μg/ml为一般田间应用浓度；而另2个浓度55.2μg/ml和5.0μg/ml是丙环唑处于防治效果易变的浓度范围；以空白清水处理作无药处理对照（CK）。结果：接种培养3天后，无药处理对照叶片发病的病斑高度达11.94cm，而施用丙环唑药液处理的叶片发病减轻，表现出有防治效果，在生产使用浓度下（187.5μg/ml），显示出高效的防治作用（99.16%）；当药液有效浓度减少，防治效果跟着下降（见表2）。本实施例的防治药物丙环唑是在病菌侵染之前施用，因而结果体现的是丙环唑的保护作用。表2用本发明的方法测定药物丙环唑在不同浓度下的防治效果ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例3应用本发明一种防治稻纹枯病药物的药效测定方法，以水稻品种中优679和稻纹枯病菌菌株Rs-3为材料，测定药物多菌灵以不同浓度防治稻纹枯病的防治效果，按实施例1的步骤1至步骤8操作实施，但与实施例1不同的是：步骤3培养准备的菌株是Rs-3；步骤4的配备防治药物是50﹪多菌灵可湿性粉剂（上海升联化工有限公司的产品），有效成分浓度调配为3个施用浓度：833.3μg/ml，35.0μg/ml，15.0μg/ml；其中833.3μg/ml为一般田间应用浓度；而另2个浓度35.0μg/ml和15.0μg/ml是多菌灵处于防治效果易变的浓度范围；以空白清水处理作无药处理对照（CK）。结果：接种培养3天后，无药处理对照叶片发病的病斑高度达9.7cm，而施用多菌灵药液处理的叶片发病减轻，表现出有防治效果，在生产使用浓度下（833.3μg/ml），显示出高效的防治作用（100%）；当药液有效浓度减少，防治效果跟着下降（见表3）。本实施例的防治药物多菌灵是在病菌侵染之前施用，因而结果体现的是多菌灵的保护作用。表3用本发明的方法测定药物多菌灵在不同浓度下的防治效果ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例4应用本发明一种防治稻纹枯病药物的药效测定方法，以水稻品种中优679和稻纹枯病菌菌株Rs-1为材料，测定药物井冈霉素对稻纹枯病防治效果的治疗作用，按实施例1的步骤1至步骤8操作实施，但与实施例1不同的是：步骤4配备井冈霉素有效成分的浓度为187μg/ml（一般田间应用浓度)。步骤6与步骤7的次序与实施例1的相反，药物施用是在接种病菌1天后，已发病（病斑高度为1.53cm）的情况下施用。结果：接种培养3天（施药2天）后，无药处理对照叶片发病的病斑高度达10.83cm，而井冈霉素药液处理的叶片发病病斑高度为3.86cm，扣除施药前的病斑高度后计算防治效果为74.95%。本实施例的防治药物井冈霉素是在病菌侵染发病之后施用，因而结果能体现井冈霉素的治疗作用。